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 NIST SRM 2366a - 巨細胞病毒DNA 旨在用于為每個樣本體積中巨細胞病毒 (CMV) 可擴增基因組的拷貝數(shù)指定一個值。 當用于分配時，實際的 CMV 校準材料 NIST SRM 2366a 可以提供對國際單位制 (SI) 組織或流體（如血漿）中 CMV 病毒載量測量結(jié)果的可追溯性。

一個單元的 標準物質(zhì) NIST SRM 2366a - 巨細胞病毒DNA 由一個無菌的 0.5 mL 全氟烷氧基 (PFA) 含氟聚合物小瓶組成，其中包含大約 150 μL 提取的 DNA，溶解在 TE 緩沖液，pH 8.0 中。 TE 緩沖液由 10 mmol/L 2-氨基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇 (Tris) 和 1 mmol/L 乙二胺四乙酸 (EDTA) 四鈉鹽在去離子水中組成。 CMV DNA的形式是細菌人工染色體——稱為CMV TowneΔ147 BAC——包含Towne菌株CMV的基因組[1,2]。

表 1. SRM 2366a 的 CMV 認證拷貝值

這些認證值是根據(jù)使用液滴數(shù)字 (ddPCR) 系統(tǒng) [3] 和平均液滴體積的直接測量進行的五次聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 測定的一致結(jié)果確定的。使用高斯隨機效應(yīng)模型 [4] 計算認證值及其不確定性。 NIST 認證值是 NIST 對其準確性有最高置信度的值，因為所有已知或可疑的偏差來源都已被調(diào)查或考慮 [5]。

不確定性：

該材料中分析物的真實值預(yù)計在給定的概率區(qū)間內(nèi)，置信水平約為 95%。出于不確定性傳播的目的，請使用規(guī)定的 u(X) 或 CV，以最適合您的目的為準；這些值與 60 個自由度相關(guān)。

可追溯性：

認證值可追溯至每體積的拷貝數(shù)，表示為每微升溶液中可擴增的 CMV 實體數(shù)，通過身份確認、ddPCR 計數(shù)測量、計數(shù)到實體的 Poisson 端點轉(zhuǎn)換的有效性，用于數(shù)字 PCR 端點[6]，以及在 NIST 進行的校準體積測量。計量溯源性是針對體積的 SI 單位。

認證到期：

 NIST SRM 2366a - 巨細胞病毒DNA 的認證在指定的測量不確定度范圍內(nèi)有效，直到 2025 年 8 月 1 日，前提是 SRM 按照本證書中的說明進行處理和存儲（參見“處理、存儲和使用說明”） 。如果 SRM 損壞、污染或以其他方式修改，則認證無效。

SRM 認證的維護：

NIST 將在其認證期間監(jiān)控此 SRM。如果在本證書到期前發(fā)生影響認證的實質(zhì)性技術(shù)變化，NIST 將通知購買者。注冊（見附表或在線注冊）將有助于通知。

處理、儲存和使用說明

處理： NIST SRM 2366a - 巨細胞病毒DNA 是一種病毒和細菌 DNA 源材料。 由于對提取的 DNA 的感染狀態(tài)沒有達成共識，請將 SRM 2366a 作為生物安全處理能夠傳播傳染病的 1 級材料 [7]。 SRM 2366a 和衍生解決方案應(yīng)根據(jù)當?shù)亍⒅莺吐?lián)邦法規(guī)進行處理。

儲存：NIST SRM 2366a 小瓶應(yīng)儲存在 2 °C 至 8 °C 之間的黑暗中。 不要凍結(jié)。

使用：在取出樣品等分試樣進行分析之前，小瓶應(yīng)通過倒置混合并離心，而無需打開小瓶蓋。 為使認證值有效，打開小瓶后應(yīng)立即取出材料并立即處理。 這些材料可以適當稀釋，但必須立即使用。 認證值不適用于重新封蓋的小瓶中剩余的任何材料。 不要將任何 DNA 溶液直接暴露在陽光下。

制備與分析

樣品制備：CMV TowneA7 BAC來自新澤西醫(yī)學院(新澤西州紐瓦克H.朱)，在NIST的大腸桿菌(E.coli)細胞中進行增殖。總DNA(CMV和E.Coli)被分離、純化并重新懸浮在TE緩沖液中。在調(diào)整濃度后，允許材料在4攝氏度的PFA容器中平衡，直到瓶裝。就在裝瓶之前，將瓶子放入層流罩內(nèi)，置于室溫下，輕輕混合。將溶液轉(zhuǎn)移到帶有自動移液管的PFA小瓶中，然后蓋上蓋子，貼上標簽，并在4℃下儲存。

CMV同源性的確認：Sanger和下一代測序(NGS)證實SRM 2366a中的CMV DNA與參考序列AY315197.2完全一致。